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酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要原材料、生產(chǎn)工藝及

質(zhì)量控制注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（報(bào)批稿）

一、前言

本指導(dǎo)原則的主要目的是規(guī)范申請人對酶聯(lián)免疫類檢測試劑的主要原材料研究資料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究資料的準(zhǔn)備，并對產(chǎn)品質(zhì)量控制提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對酶聯(lián)免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查，其它酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時(shí)，應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質(zhì)量控制

1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。使用前應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：

（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位置。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實(shí)驗(yàn)

功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗(yàn)：

（1） 牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物

無菌試驗(yàn)：將血清直接37℃放置7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2） 牛血清白蛋白：

外 觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃時(shí)，溶解時(shí)間應(yīng)≤15分鐘，pH值應(yīng)為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95％。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。

（3） 酪蛋白：

應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應(yīng)大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。

3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘?jiān)?，均?yīng)符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級(jí)別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。

4.其他物料

（1） 酶標(biāo)板

①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。

②吸附能力和精密性

采用合適的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

一般用一定濃度的正常人IgG包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算CV值。CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識(shí)管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、hook效應(yīng)等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

應(yīng)對配制過程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測定。

2.包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號(hào)、數(shù)量、標(biāo)識(shí)。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。不同批號(hào)的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），保存于2~8℃。

應(yīng)對包被過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn)、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時(shí)間等）、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的SOP要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號(hào)等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制

1.半成品質(zhì)量控制

（1）半成品抽樣

檢驗(yàn)人員按試劑的批號(hào)，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號(hào)標(biāo)記、待檢。

（2）半成品檢驗(yàn)

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。

半成品檢驗(yàn)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對定量檢測試劑，同時(shí)應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和校準(zhǔn)品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2~8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時(shí)作37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號(hào)、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗(yàn)用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫診斷試劑報(bào)批批量應(yīng)至少為10000人份。

（1）成品檢驗(yàn)

成品檢驗(yàn)時(shí)，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標(biāo)板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關(guān)抗體（和/或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強(qiáng)弱來判斷樣本中相應(yīng)的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻(xiàn)：

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社