病毒感染是危及人類健康和生命的疾病之一，目前已有很多抗病毒藥物上市應(yīng)用，但仍不能完全滿足臨床治療的需求。近年來國內(nèi)外相關(guān)制藥企業(yè)不斷投入大量資金研發(fā)抗病毒藥物，抗病毒藥物的注冊申請也逐漸受到各方面的關(guān)注。
根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)撰寫的非臨床和臨床病毒學(xué)研究報(bào)告是審評抗病毒藥物的臨床試驗(yàn)申請和上市申請的重要資料。本指導(dǎo)原則旨在幫助研發(fā)抗病毒藥物或生物制品(例如：治療性蛋白和單克隆抗體)的申請人初步了解哪些非臨床和臨床病毒學(xué)研究數(shù)據(jù)對于抗病毒藥物或生物制品申報(bào)臨床試驗(yàn)或申請上市是最關(guān)鍵的。
本指導(dǎo)原則主要關(guān)注非臨床和臨床病毒學(xué)研究報(bào)告，同時(shí)對需要收集和提交的耐藥性研究數(shù)據(jù)提出了建議。討論的主要問題包括：
l 明確作用機(jī)制
l 確定所研究藥物特定的抗病毒活性
l 評價(jià)所研究藥物與其他可能合用的抗病毒藥之間發(fā)生相互作用的可能性
l 提供病毒對所研究藥物產(chǎn)生耐藥性的研究數(shù)據(jù)
l 提供所研究藥物與已上市的其他相同作用靶點(diǎn)抗病毒藥物的交叉耐藥性的研究數(shù)據(jù)
二、背景
近年來，國內(nèi)外在抗HIV-1藥物的研究方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，也取得了很多進(jìn)展。因此，本指導(dǎo)原則以抗HIV-1藥物為范例，介紹抗病毒藥物病毒學(xué)研究的一般原則。盡管不同病毒的檢測方法和模型系統(tǒng)有較大的差異，但本指導(dǎo)原則的許多抗HIV藥物研發(fā)的原則適用于治療其他病毒感染(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、流感病毒、鼻病毒、巨細(xì)胞病毒及人乳頭瘤病毒等國內(nèi)常見病毒)的抗病毒藥物的研發(fā)。病毒學(xué)領(lǐng)域研究發(fā)展日新月異，所以，當(dāng)積累了新的資料或出現(xiàn)相關(guān)需求時(shí)，我們將對本指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂。
三、非臨床病毒學(xué)研究
非臨床病毒學(xué)研究有助于在進(jìn)行人體試驗(yàn)前評價(jià)藥物的有效性和安全性。建議申請人進(jìn)行藥物的作用機(jī)制、藥物在模型系統(tǒng)中的特定抗病毒活性的研究，并提供對藥物產(chǎn)生耐藥的病毒學(xué)數(shù)據(jù)。此外，臨床上常將一種藥物與其他已上市的治療相同適應(yīng)癥的藥物聯(lián)合使用，因此，最好通過體外試驗(yàn)研究兩種或兩種以上藥物聯(lián)合用藥的抗病毒活性，以便發(fā)現(xiàn)所研究藥物與其他抗病毒藥物之間可能存在的相互作用(如拮抗、協(xié)同、增強(qiáng)、疊加等)，尤其應(yīng)關(guān)注負(fù)面的相互作用。
由于已上市的抗病毒藥物很多，交叉耐藥(病毒對一種藥物耐藥后，對同類的其他藥物也產(chǎn)生了耐藥性)可能會成為臨床應(yīng)用中的一個主要問題。因此，在抗病毒藥物的研發(fā)過程中，下列信息顯得非常重要：
l 測定所研究藥物對相同作用靶點(diǎn)的其他已上市藥物的耐藥病毒株的抗病毒活性。
l 測定已上市藥物對由相同作用靶點(diǎn)的所研究藥物誘導(dǎo)的耐藥病毒株的抗病毒活性。
申請人在開始I期臨床試驗(yàn)前應(yīng)先進(jìn)行非臨床研究(如作用機(jī)制研究、體外抗病毒活性研究、耐藥性研究，以及血清蛋白結(jié)合率對抗病毒活性影響的研究等)。
如果病毒有合適的體外感染模型系統(tǒng)，在開始旨在考察所研究藥物與其他抗病毒藥物合用療效的臨床試驗(yàn)前，申請人應(yīng)完成所研究藥物與其他已上市的針對此病毒藥物合用的體外活性研究，如針對相同靶點(diǎn)有多種已上市的藥物和研究藥物，應(yīng)從每一類藥物中至少選一種有代表性的藥物進(jìn)行研究。
在對感染某一種病毒的患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)前，應(yīng)先通過體外試驗(yàn)誘導(dǎo)對所研究藥物耐藥的病毒株，并鑒定耐藥病毒株的表型和基因型及交叉耐藥性。
(一)作用機(jī)制研究
在I期臨床試驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行作用機(jī)制研究。充分掌握藥物的作用機(jī)制對于臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)非常重要，可使研究者了解病毒基因組中發(fā)生導(dǎo)致耐藥性突變的可能區(qū)域，這些區(qū)域不僅限于所研究藥物作用的靶位(病毒編碼的靶點(diǎn))，也可能包括酶的底物或靶蛋白復(fù)合物中存在的另外的病毒或宿主編碼蛋白。耐藥性突變的鑒定結(jié)果也可以為機(jī)制研究和臨床研究提供依據(jù)。
病毒生命周期中的許多階段都可以成為潛在的抗病毒藥物的作用靶點(diǎn)。藥物可以通過作用于病毒特異性的編碼功能而發(fā)揮直接的抗病毒作用(如酶抑制劑)，或者通過其他途徑而發(fā)揮間接的抗病毒作用(如干擾素誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞應(yīng)答)。建議進(jìn)行如下作用機(jī)制研究：
l 證明藥物具有特異性地抑制病毒復(fù)制或抑制病毒特定功能的能力。
l 確定藥物作用的靶點(diǎn)(如病毒復(fù)制酶、蛋白酶等)或作用于病毒復(fù)制的哪個階段(如病毒進(jìn)入、入核等)。
申請人可提供支持其藥物作用機(jī)制的生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等方面的數(shù)據(jù)。證明藥物作用機(jī)制的數(shù)據(jù)包括但不僅限于受體結(jié)合、抑制酶活性、確定抑制劑與受體復(fù)合物結(jié)合的X-光晶體結(jié)構(gòu)、編碼靶蛋白基因的耐藥性突變位點(diǎn)的鑒定等。
應(yīng)比較所研究藥物對病毒靶點(diǎn)及細(xì)胞或宿主蛋白作用的選擇性，當(dāng)宿主細(xì)胞中存在或可能存在與病毒酶類似的酶時(shí)，此點(diǎn)尤其重要。例如，如果藥物的作用靶點(diǎn)是病毒聚合酶，建議申請人證明該藥物對病毒聚合酶的抑制活性，同時(shí)比較其對宿主細(xì)胞的DNA聚合酶(如DNA聚合酶α、β及γ)的抑制活性。
研發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑還應(yīng)注意更多問題。此類藥物會對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用，因而可能會對病毒的復(fù)制起不到抑制作用，或者對機(jī)體產(chǎn)生其他不良影響。對于通過刺激全身免疫反應(yīng)而發(fā)揮作用的免疫調(diào)節(jié)劑，建議申請人證實(shí)其抗病毒活性，并鑒定出參與作用的免疫分子或免疫細(xì)胞。
(二)抗病毒活性
1.體外抗病毒活性
許多感染人體的病毒可以在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物宿主體內(nèi)完成完整的生命周期。在這樣的情況下，建議申請人在開始I期臨床試驗(yàn)前先通過體外試驗(yàn)證明所研究藥物和/或其代謝產(chǎn)物的特異的、可定量的抗病毒活性。這些數(shù)據(jù)應(yīng)能清楚地證明在體內(nèi)、在可接受的風(fēng)險(xiǎn)/收益比的情況下達(dá)到的藥物濃度具有抗病毒作用，從而為人體試驗(yàn)提供支持，這一點(diǎn)非常重要。此外，使用相關(guān)的細(xì)胞和病毒臨床分離株進(jìn)行的體外抗病毒活性和細(xì)胞毒性評價(jià)[見第三部分(三)細(xì)胞毒性和治療指數(shù)]可以指導(dǎo)早期臨床試驗(yàn)選擇合適的劑量范圍。
鼓勵申請人使用人靶細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗病毒活性研究。由于病毒的基因容易發(fā)生變異，所以應(yīng)使用多種臨床分離株考察所研究藥物的抗病毒活性，臨床分離株應(yīng)能代表臨床試驗(yàn)中的病毒群。建議進(jìn)行的抗病毒活性研究包括：
l 評價(jià)所研究藥物對一系列病毒實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株和臨床分離株(包括不同的亞群(clades)、亞型(subtypes)或基因型(genotypes))的特異性抗病毒活性。
l 評價(jià)所研究藥物對相同作用靶位或復(fù)合物藥物耐藥的病毒株、對其他已上市具有相同適應(yīng)癥的藥物耐藥的代表性耐藥病毒株的抗病毒活性。
應(yīng)使用定量的檢測方法，在不同濃度藥物的條件下測定病毒的復(fù)制，并與不添加藥物的測定結(jié)果進(jìn)行比較，確定藥物的劑量依賴的特異性抗病毒活性。
藥物的有效濃度是指使病毒復(fù)制的水平降低50%的濃度(細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中用EC50表示，生物化學(xué)或亞細(xì)胞試驗(yàn)中用IC50表示)。評價(jià)藥物的抗病毒活性和細(xì)胞毒性的方法包括但不局限于病毒滅活試驗(yàn)、空斑減數(shù)試驗(yàn)、細(xì)胞病變效應(yīng)抑制試驗(yàn)、病毒抗原或核酸檢測、感染性病毒顆粒檢測、含報(bào)告基因的病毒或細(xì)胞檢測等。可能影響這些試驗(yàn)的因素包括病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI)和給藥時(shí)間(如病毒感染前給藥或感染后不同時(shí)間給藥)。建議申請人使用傳代次數(shù)較少的宿主細(xì)胞進(jìn)行研究。
藥物的有效濃度與作用機(jī)制研究的數(shù)據(jù)應(yīng)一致，如果藥物抑制病毒復(fù)制所需的濃度低于根據(jù)假定的作用機(jī)制計(jì)算出的生化數(shù)據(jù)，則提示可能還存在其他的作用位點(diǎn)或機(jī)制。當(dāng)抗病毒活性數(shù)據(jù)與生化數(shù)據(jù)不一致時(shí)，可以通過耐藥性分析證明藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制。對于核苷或核苷酸類似物，建議在細(xì)胞的穩(wěn)定期及分裂期測定藥物活性分子的三磷酸鹽的半衰期(t1/2)。
某些影響人類健康的病毒(如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等)目前尚無合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物模型。對于此類病毒，可以通過對親緣關(guān)系很近的病毒關(guān)鍵功能和活性的抑制揭示藥物的潛在抗病毒活性。如果目標(biāo)病毒目前尚無合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物模型，而且藥物的作用部位被認(rèn)為位于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度與生化研究中的結(jié)果一致時(shí)，確定抗病毒藥物的活性部分能否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)尤為重要。目前用于研究乙型肝炎病毒(HBV)的細(xì)胞系和基于細(xì)胞的檢測方法還非常有限。研究丙型肝炎病毒(HCV)進(jìn)入、復(fù)制和感染的基于細(xì)胞的試驗(yàn)取得了一定進(jìn)展，但還存在很多不足。
目前用于檢測HBV復(fù)制的方法包括但不限于：
l 通過生物化學(xué)試驗(yàn)測定HBV DNA聚合酶的活性。
l 使用桿狀病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)染HBV基因組到人肝細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，然后用HBV DNA探針經(jīng)Southern Blot定量分析檢測HBV cccDNA及RI-DNA等的形成。
l 用含有HBV基因組(復(fù)制可調(diào)控或不可調(diào)控)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。
l 采用定量PCR法測量細(xì)胞外的HBV DNA。
對于HCV,目前有用于研究病毒進(jìn)入(或受體)的假病毒系統(tǒng)(HCVpp)、研究病毒復(fù)制的復(fù)制子系統(tǒng)(Replicon)以及研究完整病毒復(fù)制周期的病毒感染系統(tǒng)(HCVcc)，這些系統(tǒng)均可用于評價(jià)藥物對HCV的抗病毒活性。遺憾的是HCVcc系統(tǒng)目前僅在2a亞型中取得成功。目前用于評價(jià)藥物抗HCV活性的方法包括但不局限于：
l 體外檢測藥物對病毒靶標(biāo)蛋白(HCV RNA聚合酶、HCV絲氨酸蛋白酶)的抑制活性。
l 采用不同亞型復(fù)制子系統(tǒng)評價(jià)藥物對不同亞型HCV復(fù)制的抑制作用。通過報(bào)告基因檢測病毒抗原的表達(dá)水平，或通過RT-PCR檢測HCV復(fù)制子細(xì)胞中HCV RNA的水平。
l 在HCVcc系統(tǒng)中，通過檢測病毒中報(bào)告基因編碼產(chǎn)物(如熒光素酶或綠色熒光蛋白等)的活性反映藥物對病毒的抑制作用。也可以通過RT-PCR檢測HCV復(fù)制子細(xì)胞中HCV RNA的拷貝數(shù)，或定量檢測病毒抗原水平。
2.血清蛋白存在條件下的體外抗病毒活性
血清蛋白能與許多藥物結(jié)合或螯合，從而影響藥物的抗病毒活性。建議申請人詳細(xì)考察藥物是否能與血清蛋白顯著結(jié)合。測定藥物血清蛋白結(jié)合率的常用方法包括平衡透析法、超濾法以及基于熒光技術(shù)的高通量人血清白蛋白和α-酸性糖蛋白結(jié)合試驗(yàn)。如果藥物的蛋白結(jié)合率較高，則建議申請人在加入系列人血清稀釋液(如5%、10%、20%、40%)條件下測定藥物的體外抗病毒活性。通過這些數(shù)據(jù)可以推算出藥物在100%人血清中的EC50，同時(shí)應(yīng)報(bào)告血清校正后的EC50值。此外，建議申請人在含有生理濃度的α-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的條件下測定藥物的EC50值。
3.抑制指數(shù)
血漿藥物濃度和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度對于評價(jià)抗病毒治療的量效關(guān)系和發(fā)生耐藥的可能性非常重要，計(jì)算抑制指數(shù)(Inhibitory Quotient，IQ)時(shí)也需要用到這些數(shù)據(jù)。抑制指數(shù)(IQ)等于Cmin除以血清校正后的EC50值。測定EC50值的更多信息可參閱第三部分(二)第1節(jié)-體外抗病毒活性。IQ值是一個綜合藥物的體內(nèi)濃度和抗病毒活性的有用工具，也是描述藥物的暴露程度與病毒對藥物敏感性之間相互關(guān)系的一個指標(biāo)。如果一種藥物的IQ較高，則表明患者體內(nèi)的藥物能達(dá)到有效抑制病毒的濃度，可使耐藥發(fā)生的概率降到最低。由于同一種劑量可能并不適用于所有的患者，所以IQ值也可以用于指導(dǎo)III期和IV期臨床試驗(yàn)劑量的選擇。
4.體內(nèi)抗病毒活性
在體外抗病毒活性研究的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步通過動物感染模型來評價(jià)藥物的抗病毒活性。動物模型的分析指標(biāo)包括病毒感染后(需要有證據(jù)證明)動物發(fā)病率和死亡率、組織學(xué)檢查、各時(shí)間點(diǎn)的病毒載量、在發(fā)生病毒反彈的動物體內(nèi)耐藥株的分離和鑒定、病毒抗原和抗體的定量檢測、藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)以及癥狀(如神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、體重減少等)。
(三)細(xì)胞毒性及治療指數(shù)
申請人應(yīng)在臨床試驗(yàn)前開展藥物細(xì)胞毒性和治療指數(shù)的研究。需要證明藥物在體內(nèi)可達(dá)到的濃度下具有抗病毒活性，同時(shí)該濃度的藥物不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。應(yīng)排除測定的藥物抗病毒活性是由于宿主細(xì)胞死亡所造成的可能。這一點(diǎn)非常重要。
在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，應(yīng)設(shè)置抗病毒藥物的濃度梯度，測定導(dǎo)致50%的宿主細(xì)胞死亡的濃度[參見第三部分(二)第1節(jié)-體外抗病毒活性]，即所研究藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，通常用CC50或CCIC50來表示。治療指數(shù)或選擇性指數(shù)(即CC50/EC50)則是藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)與抑制病毒復(fù)制效應(yīng)的比值。理想的藥物應(yīng)具有最大的抗病毒活性，同時(shí)具有最小的細(xì)胞毒性(即具有較大的治療指數(shù))。
建議申請人對處于穩(wěn)定期和分裂期的各種類型的、相關(guān)的人細(xì)胞和組織細(xì)胞進(jìn)行CC50值的測定，確定藥物對不同細(xì)胞周期、不同細(xì)胞類型或不同組織的潛在毒性。
由于某些抗病毒藥物對骨髓有抑制作用，建議申請人采用細(xì)胞集落形成法評價(jià)某些藥物(如核苷類似物)對人骨髓祖細(xì)胞生長的潛在影響。此外，某些藥物也對負(fù)責(zé)正常細(xì)胞核DNA和線粒體DNA合成及修復(fù)的細(xì)胞DNA聚合酶具有潛在的抑制作用。申請人應(yīng)測定抗病毒藥物對細(xì)胞聚合酶的IC50，同時(shí)應(yīng)證明藥物對病毒靶點(diǎn)作用的特異性(與對細(xì)胞聚合酶的作用相比)。人體的DNA聚合酶γ負(fù)責(zé)線粒體DNA合成，人DNA聚合酶γ被抑制與線粒體功能缺損之間具有相關(guān)性，并會導(dǎo)致人體不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，考察某些藥物(如核苷類似物)對人聚合酶γ活性的影響以及對線粒體的毒性作用(如乳酸的生成量，線粒體DNA含量、線粒體形態(tài)學(xué)，葡萄糖利用率)就顯得非常重要。
(四)體外聯(lián)合用藥的活性分析
感染病毒的患者體內(nèi)可能存在不同的病毒變異株，其中某些類型的病毒株可能對一種或多種抗病毒藥物具有耐藥性。因此，對于某些病毒而言，同時(shí)給予多種抗病毒藥物(如抗HIV-1的聯(lián)合藥物療法)可能會比使用單一的藥物產(chǎn)生并維持更好的抗病毒作用。但是不同藥物之間的相互作用比較復(fù)雜，聯(lián)合用藥后可能導(dǎo)致藥物的抗病毒活性出現(xiàn)相互拮抗、相加或者協(xié)同等作用。因此，申請人應(yīng)在體外試驗(yàn)中評價(jià)藥物與其他已上市的、治療相同疾病藥物之間聯(lián)合用藥的抗病毒活性。具體來說，應(yīng)評價(jià)所研究藥物與所有已上市的針對相同靶點(diǎn)的藥物之間聯(lián)合用藥的抗病毒活性，對于已上市的治療相同適應(yīng)癥的不同靶點(diǎn)的藥物，應(yīng)選擇兩種或兩種以上進(jìn)行此類研究。
建議申請人在開始評價(jià)聯(lián)合用藥療效的臨床試驗(yàn)前，先完成體外聯(lián)合用藥的活性研究。有時(shí)患者會混合感染兩種或兩種以上的病毒(如：HIV與HBV或HCV共感染)，因此，體外聯(lián)合用藥活性試驗(yàn)還應(yīng)考察治療同時(shí)感染不同種類病毒的藥物與所研究藥物合用的體外抗病毒活性。
(五)耐藥性
1.體外耐藥病毒株的選擇
本指導(dǎo)原則主要關(guān)注病毒基因突變導(dǎo)致的病毒對特定的抗病毒藥物的表型敏感性降低的耐藥性。這里所說的耐藥性并不是絕對耐藥，而是一個相對的概念。建議在開始以感染特定病毒的患者為對象的臨床試驗(yàn)前，先通過體外試驗(yàn)選擇對藥物耐藥的病毒株，鑒定耐藥株的表型和基因型，并進(jìn)行交叉耐藥性分析。盡管通過體外試驗(yàn)獲得的耐藥性數(shù)據(jù)可能并不能準(zhǔn)確預(yù)測臨床耐藥性，但仍建議申請人通過體外耐藥株選擇試驗(yàn)評價(jià)目標(biāo)病毒對藥物產(chǎn)生耐藥性的屏障，從而有助于臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。
通過在細(xì)胞培養(yǎng)中選擇對藥物耐藥的病毒株，可以了解耐藥性產(chǎn)生遺傳閾值的高低。遺傳閾值低的藥物可以選擇僅含1或2個突變位點(diǎn)的耐藥株。而遺傳閾值較高的藥物則可能在病毒株中發(fā)生多處突變才產(chǎn)生耐藥性。藥物和目標(biāo)病毒的許多因素可對耐藥性產(chǎn)生影響，如藥物濃度。突變株的出現(xiàn)速率取決于病毒復(fù)制速率、產(chǎn)生的病毒基因組的數(shù)量、復(fù)制機(jī)制的保真度以及宿主因素。對這些因素的了解有助于設(shè)計(jì)檢測耐藥株的體外試驗(yàn)。例如，如果需要發(fā)生多個突變方可對藥物產(chǎn)生耐藥性，則許多細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供的病毒滴度可能不足以用于選擇耐藥病毒。遇到這種情況時(shí)，可以在逐漸增加藥物濃度的條件下使病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代，這樣可能會選擇出耐藥株。在評價(jià)耐藥性的體外試驗(yàn)中，藥物的濃度范圍應(yīng)覆蓋其在人體內(nèi)的預(yù)期濃度。選擇對藥物耐藥的突變毒株的試驗(yàn)應(yīng)在下列條件下重復(fù)進(jìn)行：使用不同的野生株、使用不同的耐藥株、高選擇壓力及低選擇壓力等，并確定不同的試驗(yàn)中產(chǎn)生的耐藥性突變的類型是否相同，以評價(jià)藥物濃度與耐藥性遺傳屏障之間的關(guān)系。
當(dāng)采用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)復(fù)制目標(biāo)病毒時(shí)，可以采用下列兩種基本方法選擇對藥物敏感性降低的病毒株：
l 病毒以較高的MOI接種宿主細(xì)胞，在多種固定的藥物濃度下分別連續(xù)傳代，誘導(dǎo)耐藥株的產(chǎn)生。
l 病毒以較低的MOI接種宿主細(xì)胞，病毒傳代期間逐漸增加藥物濃度，起始藥物濃度接近藥物對親代病毒的EC50。
采用合適的方法對病毒的復(fù)制進(jìn)行監(jiān)測，通過對選擇期間分離株的基因型和表型的鑒定，檢測耐藥毒株的產(chǎn)生。
HCV對藥物的耐藥性可以通過HCV復(fù)制子系統(tǒng)進(jìn)行考察。使用HCV復(fù)制子細(xì)胞篩選HCV耐藥性的方法包括下列幾種：
l 在含新霉素的培養(yǎng)基中，多種固定的藥物濃度下，以較低的密度培養(yǎng)HCV復(fù)制子細(xì)胞。含有耐藥性復(fù)制子的細(xì)胞將會形成集落，應(yīng)對其進(jìn)行基因型和表型鑒定。
l 在不含新霉素的培養(yǎng)基中，多種固定的藥物濃度下，進(jìn)行HCV復(fù)制子細(xì)胞傳代。收集并保存每一代HCV復(fù)制子細(xì)胞，用于表型和基因型鑒定。
2.基因型分析
針對體外試驗(yàn)中篩選出的耐藥株進(jìn)行基因型分析，確定可能導(dǎo)致病毒對藥物敏感性降低的基因突變。針對病毒基因組中的相關(guān)部分進(jìn)行DNA序列分析，鑒定耐藥相關(guān)突變，這有利于預(yù)測臨床療效，并且可以為闡述藥物的作用機(jī)制提供證據(jù)。應(yīng)測定編碼目標(biāo)蛋白的完整基因序列，對于導(dǎo)致病毒對所研究藥物耐藥的突變類型和導(dǎo)致病毒對其他同類藥物耐藥的突變類型進(jìn)行比較。對于較大的病毒(如皰疹病毒、痘病毒)，應(yīng)對其基因組中與所研究藥物作用靶點(diǎn)相關(guān)的部分進(jìn)行測序，并分析其中所含的與耐藥性產(chǎn)生相關(guān)的突變。建議在幾種遺傳背景(如毒株、亞型、基因型)中鑒定耐藥性產(chǎn)生的通路;通過選擇程序獲得的毒株如果同時(shí)出現(xiàn)了多種突變，則應(yīng)該鑒定各種突變出現(xiàn)的先后順序。
進(jìn)行基因型分析時(shí)，鼓勵申請人注明測序引物的序列，并說明這些引物可擴(kuò)增出目標(biāo)基因的堿基數(shù)。還應(yīng)說明用于檢測少數(shù)病毒亞群的基因型檢測方法的靈敏度。闡明該突變在基因型分析中的比例和種類是十分重要的。
3.表型分析
表型分析用于確定變異株對藥物的敏感性是否降低。通過基因型分析鑒定出與耐藥性產(chǎn)生可能相關(guān)的突變后，如有可能，則應(yīng)在重組病毒系統(tǒng)(即：使用定點(diǎn)突變技術(shù)，PCR擴(kuò)增突變片段并導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株或使用其他適合的系統(tǒng))中評價(jià)每一種突變導(dǎo)致表型耐藥的能力。通過體外試驗(yàn)測定重組病毒對藥物的敏感性，并確定EC50值。計(jì)算突變株與對照株(生物學(xué)特性明確的野生型實(shí)驗(yàn)室株)的EC50值之比(EC50值增加的倍數(shù))。
任何標(biāo)準(zhǔn)的病毒學(xué)試驗(yàn)方法都可用于計(jì)算病毒的表型耐藥的變化(如病毒相關(guān)蛋白檢測、PCR檢測病毒DNA或RNA、細(xì)胞病變檢測、MTT法檢測細(xì)胞毒性、報(bào)告基因表達(dá)檢測等)。通過測定突變株的EC50值，并與在相同條件下同時(shí)測得的對照株的EC50值進(jìn)行比較，計(jì)算突變株敏感性的變化(耐藥性倍數(shù)的變化)。由于試驗(yàn)中測得的EC50值比EC90或EC95值更精確，應(yīng)優(yōu)先使用EC50值。表型檢測方法的選擇取決于其靈敏度，即檢測耐藥株較對照株的敏感性變化(耐藥性的倍數(shù))的能力。計(jì)算耐藥性的倍數(shù)(耐藥株的EC50值/參比株的EC50值)時(shí)，要求表型檢測方法之間具有可比性。
4.交叉耐藥性
使用針對相同靶點(diǎn)的抗病毒藥物治療時(shí)，對某一種藥物敏感性降低的變異，同時(shí)也可能會對相同靶點(diǎn)的其他藥物的敏感性降低或喪失，這種現(xiàn)象稱為交叉耐藥。交叉耐藥并不一定是可以類推的，因此評價(jià)所有可能性非常重要。例如，如果病毒X對A藥和B藥耐藥，而病毒Y也對A藥耐藥，但病毒Y可能仍對B藥敏感。建議通過表型分析評價(jià)所研究藥物對同類的已上市藥物的耐藥毒株的有效性，同時(shí)評價(jià)同類已上市藥物對所研究藥物的耐藥毒株的有效性。此外，如果藥物的作用靶點(diǎn)相同，但結(jié)構(gòu)類型不同[例如，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)，其作用的靶點(diǎn)都是HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶]，則建議對不同類型的藥物進(jìn)行交叉耐藥性分析。建議檢測多種耐藥株和臨床分離病毒株對所研究藥物的表型敏感性(范圍應(yīng)能代表已知可導(dǎo)致病毒對同類型藥物的敏感性降低的不同突變和突變的組合)。如果表型檢測是在病毒感染細(xì)胞系中進(jìn)行的，則應(yīng)該使用臨床分離病毒株對EC50值進(jìn)行校驗(yàn)。
四、針對耐藥性產(chǎn)生的監(jiān)測
應(yīng)幫助醫(yī)生及患者了解抗病毒藥物的耐藥性信息，以協(xié)助其做出最佳的治療決策。除此之外，臨床試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和藥物研發(fā)計(jì)劃通常與藥物的耐藥性和交叉耐藥性情況密切相關(guān)。因此，強(qiáng)烈建議申請人根據(jù)藥物預(yù)期在臨床上應(yīng)用的實(shí)際情況，在藥物研發(fā)的各期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行全面的耐藥性監(jiān)測。
對于某些病毒，病毒載量的變化可作為判定抗病毒藥物臨床療效的終點(diǎn)指標(biāo)。在這種情況下，可以用測定病毒載量的方法進(jìn)行耐藥性監(jiān)測。基因型和表型檢測是考察耐藥病毒株是否出現(xiàn)的基礎(chǔ)，還有可能表明病毒的耐藥性與臨床病毒學(xué)失敗之間的關(guān)系。此外，表型和基因型檢測結(jié)果還可用于指導(dǎo)治療方法的選擇，或預(yù)測藥物在某一患者個體的療效。對治療失敗或發(fā)生了病毒反彈的患者中分離到的病毒株進(jìn)行基因型檢測可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致病毒對所研究藥物敏感性降低的基因突變。此外，進(jìn)行基線基因型和表型分析，可以根據(jù)基線病毒株的突變和多態(tài)性及表型敏感性判斷治療結(jié)果。如果病毒載量未被作為主要終點(diǎn)指標(biāo)，則建立檢測病毒載量的方法以及監(jiān)測病毒耐藥性的出現(xiàn)對于分析病毒學(xué)指標(biāo)與臨床結(jié)果之間的關(guān)系將非常重要，而且有助于完善擬進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。
建議申請人在開始以病毒感染的患者為對象的臨床試驗(yàn)前，首先制訂耐藥性監(jiān)測計(jì)劃，并作為臨床試驗(yàn)方案的一部分。耐藥性監(jiān)測計(jì)劃應(yīng)至少包含下列內(nèi)容：
l 描述檢測病毒載量的試驗(yàn)方法
l 病毒載量檢測方法及操作特點(diǎn)
l 擬采用的基因型和表型耐藥性檢測方法、步驟和操作特點(diǎn)
l 樣本采集和保存的方法
l 樣本的處理和運(yùn)輸方法(冷凍或常溫)
l 擬進(jìn)行的其他耐藥性分析
l 采集用于檢測病毒載量、基因型和表型以及其他耐藥性分析樣本的時(shí)間點(diǎn)(如基線、第24周、第48周、治療失敗或中止試驗(yàn)后)
建議申請人在藥物研發(fā)的早期階段即制訂基因型和表型耐藥的基線研究以及有關(guān)耐藥性子課題的計(jì)劃。申請人應(yīng)及時(shí)完成有關(guān)基線耐藥和治療后分離病毒株的基因型和表型分析，以便明確所研究藥物的耐藥性特征以及與其他藥物的交叉耐藥情況。對于HBV和HCV等病毒，監(jiān)測基線和治療后病毒的基因型耐藥對評估耐藥突變的發(fā)生至關(guān)重要。通過比較分析治療失敗患者的樣本和基線樣本基因型，可以發(fā)現(xiàn)與耐藥性相關(guān)的突變。試驗(yàn)方案中應(yīng)明確說明病毒學(xué)失敗和中止研究的定義。
對于以經(jīng)治患者為對象的臨床試驗(yàn)，強(qiáng)烈建議申請人收集全部患者研究初始的基線分離病毒株的表型和基因型數(shù)據(jù)，同時(shí)收集所有病毒學(xué)失敗和退出研究(病毒復(fù)制未得到抑制)等終點(diǎn)時(shí)的表型和基因型數(shù)據(jù)。并注意應(yīng)在患者仍在服用所研究藥物時(shí)完成樣本采集。
在以初治患者為對象的臨床試驗(yàn)中，應(yīng)設(shè)法獲得來自于所有病毒學(xué)失敗和中止研究(病毒復(fù)制尚未得到抑制)的患者的基線分離病毒株和終點(diǎn)分離病毒株的表型和基因型數(shù)據(jù)。在以未接受過治療的患者為對象的研究中，應(yīng)收集并保存所有患者的基線時(shí)的生物樣本，以備在病毒學(xué)失敗時(shí)進(jìn)行表型和基因型分析。
根據(jù)臨床試驗(yàn)方案或研究人群的具體情況，有時(shí)可能需要進(jìn)行額外的基因型和表型評價(jià)或亞組分析，因此在臨床試驗(yàn)的各個階段(基線及治療階段)采集并保存樣本是非常必要的。申請人有時(shí)會提出當(dāng)體外數(shù)據(jù)提示病毒在單一突變后導(dǎo)致高度表型耐藥時(shí)，在基線和病毒學(xué)失敗時(shí)收集初治患者亞組的樣本。對這樣的研究方案事先應(yīng)進(jìn)行討論。
申請人可以選擇自己進(jìn)行病毒載量的檢測和表型及基因型耐藥性分析，也可以將生物樣本委托給其他有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)室樣品的處理應(yīng)按照合適的操作程序進(jìn)行。如果某項(xiàng)試驗(yàn)未按照生產(chǎn)廠家的技術(shù)規(guī)范操作，則該試驗(yàn)的結(jié)果可能不會被接受。鼓勵申請人使用經(jīng)過鑒定和驗(yàn)證的試驗(yàn)方法。如果使用的檢測方法屬于研究性的，則建議申請人提供該檢測方法的操作特性參數(shù)(如準(zhǔn)確性、精密度、檢測限及定量限、特異性、線性、檢測范圍、耐受性、穩(wěn)定性)，同時(shí)應(yīng)描述病毒來源(如血液、血漿)、保存條件及穩(wěn)定性、細(xì)胞培養(yǎng)程序。與用于鑒定藥物的抗病毒活性及耐藥性的探索性檢測方法相比，臨床實(shí)踐中使用的檢測方法需要經(jīng)過更加全面的驗(yàn)證。研究者使用的常規(guī)商業(yè)檢測方法應(yīng)該經(jīng)過鑒定，但可能不需要提供方法學(xué)參數(shù)。申請人應(yīng)就某一檢測方法需要校驗(yàn)的次數(shù)和性質(zhì)以及相關(guān)的方法學(xué)參數(shù)[如數(shù)據(jù)主控文檔(DMF)]與審評人員進(jìn)行討論。建議申請人在III期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行特定的分析或測量時(shí)使用一致的檢測方法，對特定患者的分析檢測方法應(yīng)在試驗(yàn)期間保持不變。如果在藥物研發(fā)期間使用了任何新的檢測方法，應(yīng)提供支持這種新檢測方法的相關(guān)數(shù)據(jù)。
五、病毒學(xué)研究報(bào)告
完整的病毒學(xué)研究報(bào)告內(nèi)容比較廣泛，應(yīng)包含原始數(shù)據(jù)和相關(guān)衍生數(shù)據(jù)、獲得數(shù)據(jù)的程序和評價(jià)數(shù)據(jù)所需的信息。病毒學(xué)研究報(bào)告中應(yīng)包含藥物的非臨床研究及臨床抗病毒活性信息、接受過治療的患者的耐藥信息、與同類藥物的交叉耐藥的信息、基線基因型和表型病毒學(xué)應(yīng)答分析。
病毒學(xué)研究報(bào)告的格式通常應(yīng)包含下列部分： 概要、引言、材料與方法、結(jié)果及討論。在方法部分應(yīng)描述使用的全部試驗(yàn)方法，同時(shí)應(yīng)對使用的統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行描述。
六、總結(jié)
本指導(dǎo)原則介紹了抗病毒藥物研發(fā)和申請審評相關(guān)的病毒學(xué)研究項(xiàng)目，目的在于使對抗病毒藥物的分析更加全面。這種分析有助于提供支持藥物應(yīng)用于人體的數(shù)據(jù)，同時(shí)還有助于確定量效關(guān)系、設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)、選擇合適的患者人群。因此，這些研究數(shù)據(jù)會對藥物的治療成功率產(chǎn)生影響。
體外非臨床病毒學(xué)研究能為體內(nèi)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供有用的信息，而且有助于預(yù)測體內(nèi)試驗(yàn)中耐藥株的產(chǎn)生，所以在開始I期臨床試驗(yàn)前須先進(jìn)行非臨床研究。開展以感染某種病毒的患者為研究對象的臨床試驗(yàn)前，應(yīng)詳細(xì)分析體外試驗(yàn)中選擇到的耐藥病毒株。本指導(dǎo)原則還就如何及何時(shí)進(jìn)行病毒學(xué)研究提出了建議。這些信息可以寫入產(chǎn)品說明書中，以便臨床醫(yī)生正確開具抗病毒藥物處方，同時(shí)使治療成功率達(dá)到最大。
由于臨床治療的需求，抗病毒藥的研發(fā)已成為新藥開發(fā)的關(guān)注點(diǎn)。同時(shí)，病毒學(xué)研究的經(jīng)驗(yàn)逐漸積累，研究水平亦在不斷提高。建議申請人在開展抗病毒藥物的病毒學(xué)研究時(shí)關(guān)注本指導(dǎo)原則中提及的要素，同時(shí)鼓勵申請人就新藥臨床前和臨床病毒學(xué)研究的相關(guān)問題與審評機(jī)構(gòu)進(jìn)行討論和溝通。
參考文獻(xiàn)
FDA. Guidance for industry: Antiviral Product Development — Conducting and Submitting Virology Studies to the Agency. 2006.6
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